Спектрометр кругового дихроизма Applied Photophysics Chirascan VX

• Детальный структурный анализ биомолекул (белки, РНК, ДНК);
• Выдающаяся чувствительность обеспечивает точный и быстрый результат;
• Мощное программное обеспечение для легкой настройки прибора, вывода и анализа данных;
• Большой набор дополнительных модулей максимизирует области применения;
• Малый износ расходных материалов минимизирует расходы на эксплуатацию прибора.

Одно из принципиальных применений Chirascan — это определение вторичной и третичной структуры белков путем измерения спектров кругового дихроизма (КД), индуцированных ароматическими боковыми цепями и дисульфидными связями. Вторичная и третичная структуры белков изменяются при стрессовых воздействиях, например, изменениях температуры или рН, а круговой дихроизм используют для определения конформационной стабильности при изменениях в среде. Метод играет важную роль в разработке биотерапевтических препаратов при оптимизации условий хранения. Круговой дихроизм также используют при изучении биосовместимости для демонстрации конформационной эквивалентности материалов из разных источников, а также для определения правильного фолдинга новых белков.

На сегодняшний день качество Chirascan является стандартом, по которому все оценивают все КД-спектрометры. Система включает инновационную оптику, обеспечивающую максимальное светопропускание, особенно в дальнем УФ-диапазоне длин волн, высококлассную систему сбора и обработки информации, которая обеспечивает быструю регистрацию максимально точных и верных КД-спектров, а также не имеющую аналогов систему калибровки qCD, которая впервые позволила сделать метод кругового дихроизма количественным.

В отличие от КД-спектрометров, в которых используются аналоговые фильтры электронов, которые сглаживают (а соответственно и искажают) КД-спектры, система электронного аппроксимирования Chirascan гарантирует получение неискажённых спектров. Данная аппроксимация значительно упрощает всю процедуру, поскольку Chirascan предполагает использование схемы однолучевого спектрофотометра. Новая серия qCD представляет целый ряд особенностей, которые повышают качество и производительность, как результат сделав КД-спектроскопию действительно количественным методом. Для прибора доступен широкий спектр дополнительного оборудования, гарантирующего исследователю уверенность в максимальной эффективности и возможности совершенствования спектрометра, который может быть адаптирован ко многим областям исследований.

• Количественные измерения КД. Абсолютная калибровка по массиву точек с помощью оптического стандарта DichOS;
• Высочайшая чувствительность. Эквивалентна синхротронному излучению в диапазоне 170-260 нм;
• Инновационная оптика обеспечивает лучшее светопропускание по сравнению с более старыми системами, что обеспечивает быстрый сбор данных с низким уровнем шума;
• Цифровой сбор данных без электронной фильтрации. Фиксированная длина волны гарантирует достоверность полученных данных и предотвращает риск искажений, связанных с electronic time constants;
• 5 каналов детектирования: КД, поглощение/пропускание, НТ, температура и напряжение. Синхронный сбор данных на нескольких каналах гарантирует получение всей ключевой информации при каждом измерении;
• Pro-Data control software работает в среде операционной системы Windows и обладает большим арсеналом средств сбора, отображения и обработки данных: отображение информации в режиме online, широкий диапазон настроек монохроматора, кинетический сбор и анализ информации, сглаживание кривых после получения данных, простой переход между форматами файлов;
• Низкое потребление азота сокращает текущие расходы. Быстрое и эффективное продувание азота в сочетании с герметичным корпусом монохроматора гарантирует, что расход газа для работы в дальнем УФ-диапазоне длин волн будет составлять около 5л/мин, как на начальном этапе эксплуатации, так и в случае простоя спектрометра в течение нескольких дней;
• Подвижный детектор. Расстояние между кюветой и детектором легко настраивается, и благодаря этому настройки могут быть оптимизированы для «трудных» реагентов, например для мутных растворов;
• Программное обеспечение может быть установлено на неограниченное количество компьютеров для оффлайн просмотра и обработки информации;
• Эмулированная версия Pro-Data может быть так же установлена для оффлайн обучения работе с прибором;
• ПО для структурного анализа;
• Монитор с плоским экраном и компьютер с сетевым адаптером.

Дополнительные модули:

• CS/PCS Однокамерный термостат Пельтье;
• CS/PCM 4-кюветный механизм автоматической смены кюветы с термостатом Пельтье;
• CS/TT Двухшприцевой модуль титрования;
• CS/TF Флуоресцентный детектор;
• CS/FP Вспомогательное оборудование для флуоресцентной поляризации/анизотропии;
• CS/SM Сканирующий монохроматор;
• CS/MCD Магнитный круговой дихроизм;
• FDCD Флуоресцентно-детектируемый круговой дихроизм;
• CS/MC Мультиканальная флуоресценция;
• J100 Холодильник Julabo AWC-100 для термостата Пельтье;
• CS/LD Детектор линейного дихроизма;
• CS/ORD Вспомогательное оборудование для определения дисперсии оптического вращения;
• CS/CPL Круговая поляризация люминесценции;
• CS/IR Фотодетектор для ближней ИК-области спектра излучения;
• CS/LT Азотный криостат (дополнительное оборудование);
• CS/SF Модуль остановленного потока.

Источник света: Ксеноновая лампа мощностью 150W, воздушное охлаждение.

Стандартный детектор: ФЭУ.

Монохроматор: С двумя призмами, обе призмы поляризующие.

Калибровка КД: Камфорсульфоновая кислота.

Диапазон длин волн: 163 – 950 нм (+ опциональный ИК-детектор).

Точность установки длины волны:

• ±0.1 нм (163 — 500 нм);
• ±0.3 нм (500-600 нм);
• ±0.4 нм (600-900 нм);
• ±1.0 нм (>900 нм).

Воспроизводимость: < ±0.025 нм.

Минимальный шаг установки длины волны: 0.025 нм.

Ширина спектральной полосы: 0.01 — > 25 нм.

Точность установки ширины спектральной полосы: ±0.1 нм на 267 нм.

Ширина щели: 0,125 — 10000 мкм.

Цифровое время накопления: 0,05 мс — 200 с.

Полный диапазон КД: ± 8000 мград.

Разрешение КД: 0,000001 мград.

Динамический диапазон КД: никаких искажений КД даже при оптической плотности 3.

Рассеяние: < 3 ppm при 200 нм.

Чувствительность (стандартные значения RMS-шума без образца с шириной полосы 1 нм, временем накопления 2 с без сглаживания и использования rolling averaging): 

• 0.045 мград @ 180 нм;
• 0.045 мград@ 185 нм;
• 0.045 мград @ 250 нм;
• 0.055 мград @ 500 нм.

Стабильность базовой линии: ± 0.006 мград/час.

Температурный рампинг: Возможна съемка температурных кривых на множестве длин волн в одном непрерывном эксперименте по термической денатурации.

Максимальный расход азота, давление, чистота: 5 литров/мин на всем диазпазоне длин волн, 4 бар, 99,998%.

• Контроль продувки азотом и включения лампы через ПО;
• Предустановка и автоматическое включение подачи азота и лампы;
• Предустановка выключения подачи азота и лампы;
• Автоматическое выключение лампы при недостатке азота.

Другие стандартные возможности: Пельтье-контроль температуры, внешний температурный зонд, продвинутые режимы сканирования и кинетических экспериментов, ПО ProData Viewer для просмотра и анализа данных, включая фиттинг температурных кривых, анализ кинетики, вторичной структуры, количество компьютеров, на которых может быть установлено ПО, неограничено, USB-интерфейс.

Доступен широкий круг аксессуаров и дополнительных модулей, включая глобальный термодинамический анализ, CCD детектор эмиссии, ячейка Куэтт для ЛД, 6-позиционный держатель, титрационный модуль, pH-метр, модуль stopped flow, интеграционную сферу, держатель для тонких пленок и диск KBr, специальные детекторы для флуоресценции/анизотропии, сканирующий эмиссионный монохроматор, криостат, детекцию ORD, магнитный КД, кастомизированные держатели, 21CFR Part II compliance software и IQOQPQ Validation Service, Мультиреференсная калибровка (DichOS) – точность до ±1%.

Вес и размеры инструмента (ШхГхВ): 60 кг, 150х55х60 см.

Условия эксплуатации:

• Температура: От 20 до 25°C, контролируемая с точностью до 1,5°C;
• Влажность: От 20 до 80% без конденсации.

Введение в спектроскопию кругового дихроизма

Круговой дихроизм (КД) представляет собой разницу в поглощении левовращающей (L-CPL) и правовращающей (R-CPL) составляющих циркулярно поляризованного света и проявляется в молекулах, которые содержат один или более хиральный хромофор (светопоглощающие группы).

Круговой дихроизм = ΔA(λ) = A(λ)LCPL — A(λ)RCPL, где λ — длина волны.

Спектроскопия кругового дихроизма — это техника измерения КД-спектров на разных длинах волн. Этот метод широко используется для изучения хиральных молекул всех типов и размеров, наибольшее применение он находит применительно к большим биологическим молекулам. Основная область применения — анализ вторичной структуры или конформаций макромолекул, в частности белков. Поскольку их вторичная структура чувствительна к окружению, температуре и pH, КД можно использовать для наблюдения за изменениями вторичной структуры под воздействием внешних факторов, в том числе взаимодействий с другими молекулами. Из спектра КД можно извлечь информацию о структуре, кинетике, а также термодинамические показатели макромолекул. Измерения в видимой УФ областях спектра позволяют фиксировать электронные переходы и, если изучаемая молекула содержит хиральные хромофоры, то лево- или право-циркулярно поляризованный свет будет поглощаться лучше, и результирующий КД-сигнал на соответствующих длинах волн будет ненулевым. Сигнал КД может быть как положительным, так и отрицательным в зависимости от того которая из компонент (левая или правая) сильнее поглощает на данной длине волны. Ниже приведен пример спектра кругового дихроизма с несколькими пиками, который демонстрирует изменения сигнала КД как функции длины волны, а также возможность присутствия в одном спектре как отрицательных, так и положительных пиков.

Спектр кругового дихроизма витамина В12.

Спектры кругового дихроизма измеряются с помощью КД спектрометра, такого как Chirascan, который по принципу действия похож на обычный спектрометр, работающий на поглощение. КД спектрометры измеряют по очереди левую и правую КД-компоненту, обычно с частотой 50 кГц, а затем рассчитывают сигнал КД.

Основы поляризации

Чтобы понять явление кругового дихроизма, необходимо сначала разобраться в основах поляризации света. Линейно поляризованным называют свет, чьи колебания находятся в одной плоскости. Все состояния поляризованного света можно описать как сумму двух линейных составляющих, расположенных под прямым углом друг к другу, обычно и представляют как вертикально и горизонтально поляризованный свет. Изображения ниже служат наглядной демонстрацией.

Вертикально поляризованный свет Горизонтально поляризованный свет.

Если мы совместим горизонтально и вертикально поляризованные волны одинаковой амплитуды, находящиеся в фазе друг относительно друга, то результирующей волной (синяя) будет линейно поляризованная под углом 45 градусов, как показано на изображении ниже:

Свет, поляризованный под углом 45 градусов.

Если же две линейно поляризованных составляющих не в фазе, результирующая волна уже не будет линейно поляризованной. к примеру, если разница фаз составляет 1/4 волны, результатом суперпозиции будет спираль. Это уже циркулярно поляризованный свет. Спираль может быть как левовращающей, так и правовращающей. Оптический элемент, который превращает линейно поляризованный свет в циркулярно поляризованный четвертьволновая пластина (quarter-wave plate). Она двулучепреломляющая, то есть показатель преломления для вертикально и горизонтально поляризованного света разный. Должным образом ориентированная пластина преобразует линейно-поляризованный свет в циркулярно поляризованный за счет замедления одной из линейных компонент пучка относительно другой, таким образом, чтобы она отставала на четверть волны. Таким образом формируется пучек лево- или правовращающего циркулярно поляризованного света.

Лево-вращающий циркулярно поляризованный свет.

Право-вращающий циркулярно поляризованный свет.

Разница в абсорбции левовращающего и правовращающего циркулярно поляризованного света — основа кругового дихроизма. Молекула, которая поглощает левую и правую компоненту по-разному, называется оптически активной или хиральной.

Что такое qCD?

qCD заново определяет приложения метода спектроскопии кругового дихроизма, представляя новые принципы, которые делают КД действительно количественным методом.

Впервые КД спектрометр можно откалибровать с использованием абсолютного стандарта на множестве длин волн во всем диапазоне.

Количественная калибровка позволяет иначе взглянуть на результаты измерений КД. Необходимость такой методики была продемонстрирована Knightetal¹ (NationalPhysicalLaboratory, UK). В результате исследования была показана «невысокая достоверность метода КД вследствие большой разницы в результатах, полученных разными лабораториями и даже разными операторами», и авторы пришли к выводу, что «отсутствие абсолютного стандарта и возможностей контроля качества в КД-измерениях приводит невысокой достоверности результатов и метода в целом».

Возможности КД ограничены, если исследователи не уверены в точности своих данных. Измерения на Chirascan qCD точны, а значит несут в себе гораздо больше информации, поскольку пользователь может ставить вопрос уже таким образом: велика ли разница в КД спектре по сравнению с моими более ранними результатами или с результатами моих коллабораторов? То же самое и в фармацевтической промышленности, КД используется для сравнения больших количеств образцов, с течением времени и на разных производственных площадках – и количественные данные здесь просто необходимы. Неточные измерения при скрининге могу вылиться в большие расходы. Службы контроля и регулирующие органы все чаще требуют статистически значимые данные. А для этого необходимо иметь данные, точность которых известна.

DichOS (Dichroism Optical Standard) — это новый нехимический, мультиреференсный стандарт калибровки КД, который исключает неточности, возможные с использованием традиционного стандарта с одним референсным пиком. DichOS открывает путь к получению абсолютных значений КД, и сравнение КД-спектров, измеренных на разных приборах или в разное время становиться обычной процедурой. DichOS изготовлен из оптических компонентов с известными физическими характеристиками. Это позволяет сгенерировать референсный спектр, который и используется для калибровки спектра, снятого с DichOS. Получается калибровочная кривая с множеством точек, и ее точность составляет ±1% на всех длинах волн.

DichOS позволяет получить спектр, содержащий множество пиков от УФ до ИК областей спектра. (см. на рис. слева). Референсный спектр (красный) можно рассчитать очень точно, и его сравнивают с измеренным спектром (синий).

Точность: погрешности рассчитываются и отображаются для каждого измерения

Chirascan qCD всегда производит дискретные измерения КД. Сглаженные или полученные методом rollingaverage измерения не используются, поскольку это по сути результат наложения сигналов, полученных на разных длинах волн. В каждой точке спектра КД рассчитывается стандартная ошибка (исходя из множества измерений, сделанных на каждой длине волны). Ошибку можно отобразить в стандартной форме (см. рисунок). Погрешности, которые добавляются в результате вычислений в ПО ProData, например, коррекции базовой линии и усреднения по нескольким спектрам также рассчитываются и эти данные добавляются в файл.

Улучшенная стабильность КД

Важным параметром для КД-спектрометра является стабильность сигнала КД как функции температуры. Спектрометры qCD обладают отличной стабильностью, особенно если речь идет о колебаниях температуры. Только Applied Photophysics предоставляют такие данные в спецификации (≤0.01 mdeg/°C в диапазоне от 170 до 650 нм).

Анализ: статистическое (количественное) сравнение структур высокого порядка

Программное обеспечение qBiC. Сравнение и расчет различий в КД спектре требует измерений, точность которых известна. Это стало возможно с qCD. qBiC – это программный компонент, который позволяет производить количественное сравнение спектроскопических данных путем установления, являются ли различия в спектрах статистически значимыми. qBiC задействует множество подходов для вычисления сходства спектров.

В приведенном примере наложены 4 КД-спектра инсулина и инсулина, связанного с 2.5%, 5% и 10% lispro. На первый взгляд спектры выглядят одинаковыми. Однако статистический анализ с использованием qBiC показывает, что они отличаются и эти различия можно вычислить. В представленном исследовании использовались два статистических метода. Результаты приведены в представленной ниже таблице:

Если P < 0.05 = отличия значительны с уровнем достоверности 2-sigma (95%) или более.

Если Z > 2 = отличия значительны с уровнем достоверности 2-sigma (95%) или более.

• Seema Patel et al (Molecular interactions of ASPP1 and ASPP2 with the p53 protein family and the apoptotic promoters PUMA and Bax);
• Mark Klewpatinond, John H. Viles (Empirical rules for rationalising visible circular dichroism of Cu2+ and Ni2+ histidine complexes: Applications to the prion protein);
• David Gregson and Lindsay Cole (Structure and Thermodynamics of a Monoclonal Antibody Biotherapeutic in Different Formulations);
• AppNote CS 6-cell changer (Описание 6-позиционного держателя кювет);
• CS_SF_Tech_Datasheet (Описание модуля stopped flow);
• AppNote CS competitive binding to HSA (Пример использования метода КД при конкурентном связывании с сывороточным альбумином);
• TechNote CS SF protein refolding (Использование метода stopped flow совместно с КД при изучении рефолдинга белков);
• Chirascan Brochure qCD RUS (Брошюра Chirascan на русском языке);
• AppNote CS High Shear Couette Cell Accessory (Описание модуля ячейки Куэтта);
• AppNote CS DMS Optimising biotherapeutic development (Описание метода динамической мультимодальной спектроскопии);
• Chirascan_Platform_Brochure_final_screen (Общая брошюра о линейке Chirascan на английском языке).

• ФГБУН институт биохимии им. А. Н. Баха РАН;
• ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА России.