Система NanoTemper Prometheus

Система Prometheus на основе nanoDSF идеально подходит для:

• Скрининга буферов, рецептурных и буферных добавок, детергентов;
• Анализа термической и химической денатурации белка;
• Долгосрочная оптимизации хранения белков и антител;
• Тестов на устойчивость к принудительному разложению;
• Сравнения биоподобных белков и антител по стабильности и агрегации;
• Сплошного анализа партии;
• Анализа большого количества параметров (влияние мутаций, модификаций, конъюгаций на стабильность и агрегацию белка).

Количество образцов за цикл:

• для Prometheus NT.48: до 48 (одиночные капилляры);
• для Prometheus NT.Plex: до 24 (капиллярный чип);
• для Prometheus NT.Plex plus NT.Robotic Autosampler: до 1536 образцов (до 64 капиллярных чипов).

Требуемый объем образца: 10 мкл

Диапазон обнаруживаемых концентраций молекул: 0,005 – 250 мг/мл (стандартный IgG)

Время проведения эксперимента — термическая денатурация (от 1 °C/мин до 7 °C/мин):

• для Prometheus NT.48 и Prometheus NT.Plex: от 18 до 75 минут;
• для Prometheus NT.Plex plus NT.Robotic Autosampler: от 4 часов до ночи (384 образца).

Точность определения точки перегиба кривой при 75 °C: ± 0,1 °С

Точность/воспроизводимость отношения: 0,008

Время проведения эксперимента — химическое развертывание:

• для Prometheus NT.48 и Prometheus NT.Plex: 1 минута;
• для Prometheus NT.Plex plus NT.Robotic Autosampler: до 27 минут (384 образца).

Точность теплового перехода 1 °С/мин: ± 0,2 °С

Термоконтроль:

• Варианты выбора: от 0,1 °С/мин до 7 °С/мин;
• Диапазон температур: 15 – 95 °С (при температуре окружающей среды 25 °С).

Регистрация флуоресценции: 330 нм и 350 нм

Размеры:

• для Prometheus NT.48 и Prometheus NT.Plex: 35 см Ш x 51 см В x 52 см Г;
• для Prometheus NT.Plex plus NT.Robotic Autosampler: 110 см Ш x 188 см В x 90 см Г.

Вес:

• для Prometheus NT.48 и Prometheus NT.Plex: 30 кг;
• для Prometheus NT.Plex plus NT.Robotic Autosampler: 200 кг.

Дополнительные возможности:

• Оптика для обнаружения агрегации;
• Повышение температуры до 15 – 110 °C (при температуре окружающей среды 25 °C);
• Программное обеспечение, соответствующее 21 CFR part 11.

Метод nanoDSF предлагает множество преимуществ по сравнению с традиционными методами флуориметрии. В отличие от стандартной дифференциальной сканирующей флуориметрии, nanoDSF не требует использования флуоресцентных красителей, таких как Sypro Orange.

• Низкое потребление образца → требуется всего 10 мкл образца;
• Свободный выбор буферов для анализа → возможны также биологические жидкости, такие как сывороточный или клеточный лизат и другие добавки/детергенты;
• Очень короткое время анализа → обеспечивает высокую пропускную способность;
• Оптимальное качество данных и разрешение → двойное УФ-обнаружение на длинах волн 350/330 нм;
• Широкий диапазон температур → возможен анализ от 15 °C до 110 °C;
• Не требуется маркировка → возможен непосредственный анализ;
• Широкий диапазон концентраций от 5 мкг/мл до 200 мг/мл;
• Широкий диапазон размеров молекул → от 1 кДа до 1 МДа.

NanoDSF — метод нано-дифференциальной сканирующей флуориметрии, способен анализировать конформационную и коллоидную стабильность (поведение при агрегации) белков в различных термических и химических условиях. Конформационная стабильность белка описывается его средней температурой денатурации T_m (°C), которая является точкой, где разворачивается половина белка. Техника nanoDSF детектирует внутреннюю флуоресценцию триптофана белков, которая очень чувствительна и изменяется при термическом разворачивании.

До 48 капилляров заполняются 10 мкл образца и одновременно сканируются на длинах волн 330/350 нм. Температуры плавления регистрируются путем мониторинга изменений собственной флуоресценции триптофана, а температуры начала агрегации регистрируются с помощью рассеяния света с обратным отражением. Образцы могут быть нагреты до любой температуры в диапазоне от 25 °С до 95 °С. Важно отметить, что образцы могут быть изучены без использования красителя и со свободным выбором буфера. Температуры плавления белков с концентрацией от 5 мкг/мл до 250 мг/мл могут быть проанализированы. Для получения высоких температур начала агрегации требуются белковые растворы с концентрациями выше 1 мг/мл.

NanoDSF (нано-дифференциальная сканирующая флуориметрия) — это быстрый, надежный, высококачественный метод, не требующий флуоресцентных меток и растворов для анализа стабильности белка, термической денатурации белка и анализа температуры плавления на основе собственной флуоресценции триптофана. NanoDSF является отличным инструментом для скрининга буферов и детергентов, а также позволяет анализировать коллоидную стабильность растворов белков (агрегацию).

В целом, собственная флуоресценция триптофана белков сильно зависит от их 3D-структуры и, следовательно, от локального окружения остатков триптофана. При использовании химических денатуратов или термического градиента белки могут быть развернуты, что приводит к изменениям собственной флуоресценции триптофана. Это приводит к сдвигу пиков флуоресцентного излучения и изменениям интенсивности. NanoDSF отслеживает эти флуоресцентные изменения с высоким временным разрешением и может выявить даже несколько разворачивающихся переходов. Поэтому NanoDSF весьма успешен в разработке антител, характеристике мембранных белков, контроле качества белка, скрининге буфера, анализе разворачивания белка и скрининге связывания низкомолекулярных соединений.

Рисунок 1. Принцип, лежащий в основе термической денатурации белка: повышение температуры вызывает денатурацию третичной структуры белка и, таким образом, остатки триптофана, подвергаются воздействию растворителя. NanoDSF отслеживает параллельные изменения флуоресценции триптофана на длинах волн 330 и 350 нм.

Для обнаружения агрегации белка система Prometheus имеет оптику с обратным отражением. Обычно видимый свет проходит через капилляры, содержащие образец интересующего белка, без каких-либо помех, отражается зеркалом на капиллярном поддоне и, наконец, количественно определяется детектором. Если образец белка содержит агрегированные частицы, падающий свет рассеивается этими частицами. Потеря интенсивности отражения является точным показателем агрегации белка.

Stability liabilities of biotherapeutic proteins: Early assessment as mitigation strategy

Lobo, S., Baczyk, P., Wyss, B., et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2021, vol: 192 doi: 10.1016/j.jpba.2020.113650

Peptide-MHC I complex stability measured by nanoscale differential scanning fluorimetry reveals molecular mechanism of thermal denaturation

Saikia, A. and Springer, S., Molecular Immunology 2021, vol: 136 doi: 10.1016/j.molimm.2021.04.028

Understanding unfolding and refolding of the antibody fragment (Fab). I. In-vitro study

Gani, K., Bhambure, R., Deulgaonkar, P., et al., Biochemical Engineering Journal 2020, vol: 164 doi: 10.1016/j.bej.2020.107764

An application of nano differential scanning fluorimetry for higher order structure assessment between mAb originator and biosimilars

Joshi, S., Maharana, C., Rathore, A., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2020, vol: 186 doi: 10.1016/j.jpba.2020.113270

Stepwise conformational stabilization of a HIV-1 clade C consensus envelope trimer immunogen impacts vaccine-induced antibody responses

Hauser, A., Carnell, G., Held, K., et al., Vaccines 2021, vol: 9(7) doi: 10.3390/vaccines9070750

Rapid development of SARS-CoV-2 spike protein receptor-binding domain self-assembled nanoparticle vaccine candidates

Kang, Y., Sun, C., Zhuang, Z., et al., ACS Nano 2021, vol: 15(2) doi: 10.1021/acsnano.0c08379

Thermodynamics of amyloid fibril formation from non-equilibrium experiments of growth and dissociation

Norrild, R., Vettore, N., Coden, A., et al., Biophysical Chemistry 2021, vol: 271 doi: 10.1016/j.bpc.2021.106549

Methods Matter: Standard production platforms for recombinant AAV produce chemically and functionally distinct vectors

Rumachik, N., Malaker, S., Poweleit, N., et al., Methods and Clinical Development 2020, vol: 18(11) doi: 10.1016/j.omtm.2020.05.018

Understanding the process-induced formation of minorconformational variants of Erwinia chrysanthemi L-asparaginase

Gervais, D., Hayzen, J., Orphanou, C., et al., Enzyme and Microbial Technology 2017, vol: 98 doi: 10.1016/j.enzmictec.2016.12.003

Quantitation of trace levels of DNA released from disrupted Adeno-associated virus gene therapy vectors

Bee, J., O’Berry, K., Zhang, Y., et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 2021, doi: 10.1016/j.xphs.2021.06.010

Prometheus_Brochure_new

Prometheus Panta_Brochure

Prometheus_Stability_Analysis_Software